Nata come pia fondazione degli Amalfitani a Gerusalemme, amministrava una chiesa e un ospizio vicino al Santo Sepolcro, e si dedicava all'attività ospedaliera e all'assistenza dei pellegrini in Terra Santa almeno dalla seconda metà del sec. XI.
Al momento della conquista di Gerusalemme nel 1099, la confraternita religiosa era guidata da Gherardo. L'entrata massiccia dei cavalieri latini in Terra Santa moltiplicò le attività dell'Ordine. Nel 1123 una Bolla di papa Pasquale II attribuiva ai Gerosolimitani le caratteristiche formali di un ordine religioso della chiesa romana. L'Ordine fu poi costretto dalla situazione politico-militare ad assumere anche compiti difensivi e militari. Da quel momento il nucleo dell'Ordine sarà composto da frati cavalieri, frati servienti e frati cappellani, tutti e tre con voti religiosi di castità, povertà ed obbedienza e compiti ospedalieri e militari.
La prima notizia dell'esistenza di un Priorato Gerosolimitano a Venezia si ha con una lettera di papa Nicolò IV datata 11 settembre 1292 con la quale si ordina al Priore dell'Ordine di San Giovanni a Venezia di impiegare metà delle sue risorse per il sostentamento delle galee inviate in Terra Santa.
Dapprima l'abito dei membri dell'Ordine era una tunica nera con una semplice croce di stoffa bianca, cucita sul petto. Frà Raimondo de Puy introdusse, con la prima Regola dell'Ordine, la croce bianca ottagonale (la croce di Malta), che è rimasta emblema dell'Ordine. La tradizione vuole che la benemerita croce di Malta rappresenti e ricordi perennemente le otto beatitudini evangeliche.
La marina dell'Ordine fu probabilmente la prima nell'Europa del Medioevo ad usare uniformi uguali. I cavalieri infatti portavano tutti sopra la corazza la sopravveste dell'Ordine rossa con croce latina bianca (la croce di Malta era usata come segno personale di appartenenza all'Ordine e non come simbolo militare).
La marina dell'Ordine, con la sua flotta, dovette consegnarsi nel 1798 al corpo militare della spedizione in Egitto di Napoleone, rompendo la neutralità di un Ordine religioso i cui cavalieri avevano promesso di non battersi contro altri cristiani. Il 12 giugno 1798, dopo più di cinquecento anni di gloriosa esistenza, le bandiere rosse e bianco-crociate furono ammainate per l'ultima volta.
A Venezia esiste ancora la Chiesa di San Giovanni Battista sede del Gran Priorato di Lombardia e Venezia dell'Ordine di Malta (Castello 3253).
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