Sequenziamento del DNA- Prima generazione (metodo Sanger)

Era da un po’ di tempo che volevo parlare delle tecniche di sequenziamento del DNA, ma avevo un dubbio: meglio trattare l’argomento in un unico lunghissimo post, oppure spalmarlo su tre post più brevi, ognuno dedicato a una delle tre generazioni di sequenziamento? Ho deciso per la seconda opzione, principalmente perché io stesso quando mi imbatto in un post chilometrico tendo a non leggerlo. Così, ecco la prima parte della mia serie sul DNA sequencing: oggi tratterò la prima generazione, vale a dire il metodo Sanger.

Innanzitutto facciamo un piccolo ripasso sul DNA. Il DNA (o acido deossiribonucleico) è una molecola che ha l’aspetto di una doppia elica formata da due catene di nucleotidi. I nucleotidi sono piccole molecole costituite da un gruppo fosfato, uno zucchero (deossiribosio) e una base azotata; mentre le prime due componenti sono sempre uguali e costituiscono l’ossatura della doppia elica, le basi azotate esistono in quattro “versioni” differenti. Esse si chiamano Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T), e godono di una proprietà importante: la complementarietà. In una molecola di DNA, una A si troverà sempre davanti a una T, così come una C si troverà sempre davanti a una G: questo significa che non è necessario sequenziare entrambi i filamenti, basta avere una delle due sequenze e quella complementare si potrà ricavare facilmente.

Prima di passare alla lettura del DNA, cioè al suo sequenziamento, è necessario amplificare il frammento di DNA di interesse. Per farlo, si esegue una reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction). Questa tecnica, inventata dal geniale quanto eccentrico Kary Mullis, sfrutta un enzima normalmente presente nelle nostre cellule, la DNA polimerasi. Utilizzando un filamento come stampo e un piccolo tratto di DNA come innesco, la DNA polimerasi è in grado di sintetizzare l’altro filamento agganciando uno dietro l’altro i nucleotidi corretti. Per moltiplicare centinaia di volte il pezzo di DNA che ci interessa è sufficiente dare alla polimerasi i nucleotidi (dNTP) e gli inneschi corretti (primer), disegnati ai lati della nostra sequenza. Riscaldando la miscela, la doppia elica si apre liberando i due filamenti, che potranno così essere raggiunti dalla polimerasi quando la temperatura verrà fatta scendere. Ripetendo diverse volte questo ciclo, si ottiene l’amplificazione del frammento di DNA che ci interessa.

Ora che il nostro DNA è stato amplificato, si può iniziare a leggere la sua sequenza. La tecnica inventata da Fred Sanger prevede ancora l’utilizzo di una polimerasi, ma questa volta ai nucleotidi tradizionali se ne aggiungono delle varianti speciali chimicamente modificate: i dideossiribonucleotidi. Quando vengono aggiunti al filamento in formazione, questi nucleotidi hanno la caratteristica di bloccare la sintesi del DNA: la polimerasi non riesce più ad aggiungere altri nucleotidi, e rilascia un frammento “monco”. A questo punto bisogna fare due cose: misurare la lunghezza di questo frammento e riconoscere il dideossiribonucleotide che si era legato per ultimo. Con queste due informazioni in mano leggere la sequenza è immediato: se ho ottenuto un frammento lungo 10 nucleotidi dove l’ultimo nucleotide aggiunto è una G, io so che in 10° posizione c’è una G. Un tempo per fare questo si eseguivano sullo stesso DNA quattro reazioni separate, per ognuna delle quali si utilizzava un dideossinucleotide diverso: ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP. Al termine della reazione, si prendevano i frammenti generati da ogni reazione e li si misurava mediante un’elettroforesi su gel: in questo gel, le molecole più lunghe si muovono più lentamente e tutti i frammenti possono quindi essere separati. Al termine, si ricostruiva la sequenza. Con l’avvento dei sequenziatori automatici, si è iniziato a fare tutto in un’unica miscela di reazione, etichettando ogni base azotata con una molecola fluorescente di colore diverso; inoltre, i frammenti si separano in tubi capillari, con un lettore ottico che registra il colore emesso dal DNA al suo passaggio.

L’invenzione di questo metodo di sequenziamento ha segnato una svolta epocale nel campo della biologia molecolare e lo dimostra il fatto che Fred Sanger ricevette per questo motivo un premio Nobel nel 1980. Tuttavia, occorre molto tempo per sequenziare in questo modo lunghi tratti di DNA: per sequenziare un milardo di basi (circa un terzo del genoma umano) è necessario più di un anno di lavoro! Inoltre, è una tecnica molto costosa: si spendono 10 centesimi di dollaro ogni mille basi. Per questi motivi si è passati ora a tecnologie di sequenziamento molto più efficienti ed economiche, le cosiddette tecnologie di seconda generazione che tratterò prossimamente.